干貨 | C18柱的選擇技巧你知道多少！
2023-03-06
在藥物分析中高效液相色譜法用得非常普遍， 而色譜柱的選擇直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果與藥物的質(zhì)量控制。不同C18色譜柱的保留行為千差萬別， 選擇適宜的色譜柱對(duì)分析樣品至關(guān)重要。以C18色譜柱的內(nèi)部化學(xué)鍵合相為切入點(diǎn)， 介紹C18色譜柱的差異，并綜述在不同的pH環(huán)境、流動(dòng)相極性、藥物極性等條件下以及根據(jù)色譜柱的分類系統(tǒng)選擇合適的鍵合相，為如何正確快速的選擇C18色譜柱提供參考。
高效液相色譜（HPLC）法選擇性高、靈敏度高、分析速度快，而且大部分可以溶解的藥物能用該法分析，所以該技術(shù)已經(jīng)成為藥物分析的首選。色譜柱是高效液相分離系統(tǒng)的中最重要的環(huán)節(jié)，業(yè)內(nèi)常把色譜柱比喻為液相色譜的心臟，因?yàn)樯V柱的類型決定了色譜系統(tǒng)的性質(zhì)，色譜柱的粒徑和長(zhǎng)度影響了分析時(shí)間和分析效率。氨基柱、苯基柱、氰基柱等正相色譜柱和C18、C8等反相色譜柱是藥物分析與評(píng)價(jià)工作中最常見的兩類色譜柱。
以碳十八硅烷化學(xué)鍵合硅膠固定相（C18或ODS）的反相色譜出色地完成了液相色譜分析任務(wù)，而且與其他色譜相比，C18反相色譜有明顯的優(yōu)勢(shì)，它可直接進(jìn)樣分析水溶性樣品，因而適用范圍廣，被譽(yù)為“標(biāo)準(zhǔn)固定相分離模式”。
各國(guó)藥典涉及使用液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)的品種當(dāng)中，C18色譜柱作為固定相應(yīng)用最為廣泛。目前市場(chǎng)上有600多種C18色譜柱，且不斷有新的色譜柱出現(xiàn)。采用不同的C18色譜柱分析具體樣品時(shí)，保留時(shí)間、溶質(zhì)之間的分離情況、出峰順序等色譜柱的保留行為都可能出現(xiàn)較大的差異、《美國(guó)藥典》（USP）、《歐洲藥典》和《日本藥局方》對(duì)色譜柱的規(guī)定比較詳細(xì)，除注明填料所屬的大類別外，通常還給出色譜柱的內(nèi)徑、長(zhǎng)度、粒徑、比表面積等信息，有些品種還會(huì)直接注明色譜柱的廠家。
在美國(guó)藥典委員會(huì)網(wǎng)站可查詢到USP推薦的色譜柱品牌與型號(hào)。而《中國(guó)藥典》僅指明色譜柱的填料大類，如十八烷基硅烷鍵合硅膠。由于《中國(guó)藥典》缺少選擇色譜柱方面的詳細(xì)指導(dǎo)，使得藥典推薦方法的執(zhí)行遇到困 難。在參考文獻(xiàn)執(zhí)行某一HPLC方法時(shí)，當(dāng)無法獲得文獻(xiàn)中所用色譜柱時(shí)，需要尋求選擇性相似的色譜柱代替。
十八烷基硅烷（常被稱為ODS或C18）是最早的鍵合固定相之一，C18是具有烷基鏈的硅烷化劑與硅膠表面的硅醇基反應(yīng)制得的鍵合相。因?yàn)槭褂昧斯矁r(jià)鍵和的方式將烷基鏈緊緊固定在硅膠表面，所以烷基鏈不會(huì)被流動(dòng)相沖洗掉，作為色譜固定相穩(wěn)定發(fā)揮作用。C18色譜柱因鍵合方式的不同、粒徑的不同、長(zhǎng)度的不同，內(nèi)徑的差異等多方面因素，呈現(xiàn)出不同選擇性。這樣，在市場(chǎng)上就出現(xiàn)了數(shù)百種具有不同分離選擇特性的C18色譜柱。
2010年版《中國(guó)藥典》增加了麥白霉素A有關(guān)物質(zhì)及其組分的檢查，但并未指定C18色譜柱的型號(hào)和品牌。C18色譜柱能對(duì)麥白霉素A中各組分能達(dá)到較好分離。不同C18色譜柱之間的分離度差別較大，影響藥物有關(guān)物質(zhì)和組分的測(cè)定。
相同規(guī)格的C18色譜柱由于生產(chǎn)廠家的不同也會(huì)產(chǎn)生較大的分析差異。用5種相同規(guī)格、不同生產(chǎn)廠家的C18色譜柱測(cè)定胸腺法新有關(guān)物質(zhì)，結(jié)果5種C18色譜柱表現(xiàn)的分離度和保留時(shí)間差異很大。有的色譜柱表現(xiàn)的分離效果甚至不符合藥典的要求。用3種同規(guī)格不同品牌的C18色譜柱考察了不同廠家色譜柱對(duì)注射用氫化可的松琥珀酸鈉與相關(guān)物質(zhì)分離的效果。其中兩種C18色譜柱出峰順序不符合《中國(guó)藥典》規(guī)定?？梢姎浠傻乃社晁徕c對(duì)于色譜柱固定相的選擇性很強(qiáng)。C18色譜柱內(nèi)部填料的粒度、孔徑、鍵合量及填充的工藝、技術(shù)等差異是上述現(xiàn)象的主要原因。
分析化學(xué)中可以根據(jù)pH環(huán)境、流動(dòng)相極性、色譜柱的分類系統(tǒng)、藥物極性等來選擇合適的C18色譜柱。因?yàn)樵谒幬锓治鲋?，藥物的極性一般是無法改變的，所以下文主要介紹根據(jù)pH環(huán)境、流動(dòng)相極性、色譜柱的分類系統(tǒng)來選擇C18色譜柱。
對(duì)于傳統(tǒng)的C18色譜柱，pH值使用范圍通常為2～7，因?yàn)閜H值高于8時(shí)C18固定相會(huì)受到限制。由于殘余硅羥基的存在，易對(duì)堿性化合物造成不可逆吸附，造成峰拖尾，影響分離與分析。pH值太低則會(huì)使鍵合的烷基脫落，而且對(duì)成分的分離達(dá)不到要求。
為了改善C18色譜柱在低pH值時(shí)的穩(wěn)定性，有人提出了空間位阻方法。空間位阻作用是指連接較大基團(tuán)，立體阻礙溶質(zhì)基團(tuán)進(jìn)攻硅醇基，使硅氧烷能夠再生，提高了化學(xué)鍵合固定相抗水解的能力。還有人制備了側(cè)鏈中含有異丙基或異丁基的C18化學(xué)鍵合固定相。該固定相由于引入了較大的側(cè)鏈基團(tuán)，立體阻礙了殘留硅醇基與溶質(zhì)之間的相互作用，在低pH值條件下能夠保持穩(wěn)定，這種化學(xué)鍵合固定相更適合酸性物質(zhì)的分離。Zorbax Stable Bond C18色譜柱就使用了空間位阻技術(shù)，其使用單官能團(tuán)硅烷，具有較大的二異丁基（SB-C18）側(cè)鏈基團(tuán)，空間位阻關(guān)鍵的硅氧烷鍵合到硅膠表面，以避免在低pH值條件下水解破壞，在酸性流動(dòng)相條件下提供良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。因此，Stable Bond色譜柱成為低pH值方法開發(fā)的首選。在方法開發(fā)初期，若選定流動(dòng)相為酸性，可將此類色譜柱作為首選。
制造快速分離堿性化合物的化學(xué)鍵合相一直是研究熱點(diǎn)。雙齒鍵合固定相的每個(gè)硅烷化分子中含有兩個(gè)硅原子，兩個(gè)硅原子之間以-O-或-CH2-CH2等基團(tuán)連接，每個(gè)硅原子含有1個(gè)C18官能團(tuán)。它的環(huán)狀結(jié)構(gòu)無論在低pH值條件下，還是高pH值條件下均顯示了較高的穩(wěn)定性和滿意的柱效。與傳統(tǒng)的單齒化學(xué)鍵合相相比，這種化學(xué)鍵合固定相最突出的優(yōu)點(diǎn)是在低、中、高pH值時(shí)都有很好的穩(wěn)定性。使用C18雙齒化學(xué)鍵合固定相的商品柱有Zorbax Extend-C18色譜柱，其耐受pH值達(dá)11.5，特別適合在高pH值的流動(dòng)相條件下對(duì)強(qiáng)堿性化合物進(jìn)行有效的色譜分離、Janina等在開發(fā)普魯卡因有關(guān)物質(zhì)的藥物分析方法中，對(duì)比8種C18色譜柱，最終選擇了耐受pH值范圍較大的Zorbax Ex tend C18色譜柱。分析樣品與雜質(zhì)均為堿性，使用Zorbax Extend C18使各雜質(zhì)與組分間分離最佳。若堿性物質(zhì)間的分離效果不佳，可以考慮使用上述鍵合相填料的C18色譜柱
極性基團(tuán)嵌入化學(xué)鍵合相技術(shù)是分離極性較大物質(zhì)的一個(gè)方法，這種鍵合相可以在強(qiáng)極性流動(dòng)相條件下長(zhǎng)期使用。Symmetry Shield TM RP C18色譜柱是嵌入了氨基甲酸酯基團(tuán)的反相色譜柱，Sunil等]用該固定相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）對(duì)鹽酸小檗堿進(jìn)行HPLC分析。實(shí)驗(yàn)中流動(dòng)相為強(qiáng)極性水，鹽酸小檗堿為堿性化合物。通過對(duì)比其他色譜柱，上述色譜柱的理論塔板數(shù)最高，沒有拖尾現(xiàn)象。嵌入了氨基甲酸酯基團(tuán)的鍵合相不但阻止了殘留硅醇基與堿性化合物之間的作用，而且提高了水潤(rùn)濕性，特別適合在使用極性流動(dòng)相情況下分離堿性物質(zhì)。
中草藥成分較為復(fù)雜，含有較多極性非極性等組分。在研究血暢寧組方中總皂苷的HPLC法分析，采用Fusion-RP C18色譜柱，在強(qiáng)極性流動(dòng)相條件下，各類極性不同的皂苷組分間達(dá)到最佳分離。Fusion-RP C18色譜柱由于鍵入了極性基團(tuán)，而且擁有疏水鏈，其可以在100%的水相流動(dòng)相條件下長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)轉(zhuǎn)，特別適合于在強(qiáng)極性條件下分析含有極性和非極性化合物的混合物。
重復(fù)某一方法，但由于某種原因無法獲得目標(biāo)色譜柱時(shí)，需要選擇與目標(biāo)色譜柱有相似保留行為的色譜柱來開展實(shí)驗(yàn)。通過對(duì)色譜柱的保留行為進(jìn)行表征，可以快速選擇出相似色譜柱。反相色譜柱的方法從20世紀(jì)70年代開始就一直被廣泛研究。該色譜柱分類系統(tǒng)可以表征色譜柱的保留行為，進(jìn)而可以進(jìn)行色譜柱的選擇和對(duì)比。
不同C18色譜柱之間的保留行為差別很大，選擇合適的C18是藥物分析工作的重點(diǎn)。需要一種科學(xué)的方法對(duì)色譜柱進(jìn)行表征和分類，然后才可以進(jìn)行快速的選擇。目前，各類新型的C18鍵合相層出不窮，從鍵合相類型方面對(duì)其分類較為困難。而且，色譜柱的選擇行為與鍵合相的類型關(guān)系不大。所以本文只是論述了在酸堿情況下如何選擇分離效果較好的C18鍵合相及強(qiáng)極性條件下如何選擇耐用的C18鍵合相，并未就此進(jìn)行色譜柱的分類歸納。
武漢法奇代理的安徽色譜柱采用單分散硅膠微球制備技術(shù)，將CV值降低至1%；運(yùn)用硅膠微球整體雜化技術(shù)，在美國(guó)NIST，SRMR870標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試中，在死體積測(cè)試、保留性能及柱效測(cè)試、金屬離子殘留測(cè)定、表面羥基活性測(cè)試中均不輸進(jìn)口色譜柱，同時(shí)其在耐酸堿測(cè)試中能達(dá)到驚人的PH1-12，且沖洗10天色譜柱性能無變化！
測(cè)試結(jié)果
10天強(qiáng)堿條件色譜柱柱效測(cè)試